·导语·
在科研界，细胞增殖和细胞凋亡检测实验绝对占据了细胞实验领域中的半壁江山。为了尽早发表高分文章、走上人生巅峰，奋斗在科研第一线的小伙伴们无不希望能早些拿下这两个实验。小鱼特地汇总一些久经考验的可靠方法来检测细胞增殖或细胞凋亡。大家可以选择最适合自己的检测方式，好结果自然就会水到渠成。
Brdu&EdU均是胸腺嘧啶的衍生物，均可代替胸腺嘧啶在DNA合成期掺入细胞中。
不同的是，Brdu检测法可利用Brdu专一性抗体和其他细胞标记物对细胞进行双重染色，可判断增殖细胞的种类及增殖速度，不仅适用于体外实验也能用于活体实验。这个方法最大的缺点需要变性DNA才能与抗体结合，破坏了DNA双链结构，导致染色弥散、准确性降低等问题。
EdU检测法则基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,在细胞内很容易就扩散，无需DNA变性。
MTT检测法反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便准确方法。其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解为蓝紫色的水不溶性的甲瓒（Formazan），并沉积在细胞中，死细胞无此功能。DMSO溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联检测仪在490nm波长处检测其光密度值，可间接反映活细胞数量。
CCK8是MTT的升级版，CCK-8细胞活性检测试剂中含有WST-8（MTT的类似物），在电子耦合试剂存在的情况下，可被线粒体中的脱氢酶还原成橙黄色的甲瓒（Formazan），用酶联检测仪在450nm波长处检测其光密度值，可间接反映活细胞数量。
细胞增殖越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，可逆的与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上，是种良好的细胞标记物。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此CFSE荧光强度呈对逐级递减，可利用流式细胞仪对其进行分析。
Ki-67是目前较为肯定的核增殖标志物，它只参与增殖细胞核反应，其表达增强是细胞有丝分裂、增殖活性增强的一个可靠标记，研究表明Ki-67的表达能可靠而迅速的反应恶性肿瘤的增值率。
细胞凋亡视频：
1、通过光学显微镜或倒置显微镜观察细胞形态。
1)未染色细胞
凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
2)染色细胞
常用吉姆萨染色、瑞氏染色等，凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2、通过荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察细胞形态
以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。该法中常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342, Hoechst 33258,DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
细胞凋亡中细胞核染色质的形态学改变分为三期：I期的细胞核呈波纹状或折缝样，部分染色质出现浓缩状态；II a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；II b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
3、通过透射电子显微镜观察细胞形态
凋亡细胞体积变小，表面微绒毛消失，细胞质浓缩。
凋亡I期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构；II a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
凋亡细胞的细胞表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。
细胞凋亡中，染色体DNA双链或单链断裂而产生大量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到3’-OH末端，从而可进行凋亡细胞的检测。
因而，线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、JC-1、TMRM等可接合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
Caspase家族在凋亡信号转导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原（32kD）的形式存在于胞浆中，在凋亡早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17kD）和两个小亚基（12kD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡，但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
综上，小鱼总结了细胞凋亡分析总体原则：
- 凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；需多指标同时检测。
- 凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同，而每个指征维持一段时间，则需要在不同的时间点进行采样，以保证检测结果的准确性
- 实验需设定阳性＆阴性对照，避免出现假阳性或假阴性。
来自：解螺旋·医生科研助手
