实时荧光定量PCR之SYBR染料法详解

实时荧光定量PCR（qPCR）通过仪器实时检测反应体系中的荧光值变化，能够准确体现出模板中相应基因的相对表达量变化，成为生命科学领域一项非常重要且常规的技术。这项技术不仅能够检测不同样本中相应的基因表达量，并且被广泛应用于临床疾病诊断、食品安全及动物疾病检测等等行业。

共同点：只要是PCR，就都涉及到DNA聚合酶的扩增以及温度循环过程，因此，常规PCR所含有的体系（如DNA聚合酶、模板、引物等），qPCR是同样需要的。

不同点：由于qPCR的实时性，相对与常规PCR只检测反应终点，qPCR在反应的所有循环过程中均进行一次检测，因此能够准确体现出反应进行过程中任意循环的模板/产物数量变化。

由于PCR的过程实质上是dNTP单体在DNA聚合酶的作用下不断组装成为模板的过程，而直接检测模板量的变化是比较困难的，因此，为了检测出这种变化，必须采用一种额外的物质指标，通过检测该指标从而间接体现出模板量的变化。而这个指标，就是荧光。

SYBR Green I是一种非对称花菁染料，能够结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域。在游离状态下，SYBR Green I只能发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。

因此当将SYBR染料添加到PCR反应体系中去时，SYBR仅能结合到模板和扩增产物中发出荧光，随着每轮扩增，产物量呈指数型上升，荧光也随之上升并被仪器检测到。

从上述原理中可以看出，与常规的PCR体系相比，SYBR染料法荧光定量PCR的体系最大的区别就是额外添加了荧光染料SYBR Green I，使得体系中的双链DNA量跟荧光强度呈正相关。

1. 通用性

由于SYBR Green I 染料结合dsDNA的非选择性，因此染料法的通用性强，无论要检测什么基因，除了基因对应的引物不同之外，不需要作任何变化。

2. 便捷性

现在绝大多数厂家生产的染料法荧光定量PCR酶已经做成了2 × Mix，使用者仅需添加模板、引物和水即可进行反应，使用非常方便。

3. 价格低廉

做染料法荧光定量PCR仅需要设计与合成特异性引物，不需要合成昂贵的探针或其他试剂，而引物的价格非常便宜，就算特异性不好也可以立即更换引物而不会耗费太大的代价。

正是由于上述三个优点，SYBR Green I 染料法成为了国内甚至国际上最常用的荧光定量PCR检测方法。

1. 特异性

但正是由于SYBR Green I 结合dsDNA的无差别性，任何双链DNA都会结合SYBR从而产生信号，因此在设计qPCR引物以及设置程序的时候，要尽力避免非特异性产物以及引物二聚体的产生。同时，在qPCR之后，需要添加熔解曲线的检测步骤，以保证结果数据的真实可靠。

小编经常在日常工作中遇到在选取引物过程中苦苦挣扎的研究者们，如果遇到引物不佳的情况，何不看看之前的相关往期推送，教大家一个正确的引物选取姿势。另外，赶时间的小伙伴们不妨也可以一次性设计并合成多对引物同时进行检测，选取其中表现上佳的引物，毕竟引物没多少钱，时间才是最宝贵的~

2. 无法进行多重检测

多重PCR可以在同一个体系中同时进行多个指标的检测，例如，常规PCR可以规定不同的产物大小，对模板中多个靶标进行同时检测。但对于染料法qPCR就不适用了，因为SYBR Green的结合是非选择性的，仪器检测的也是反应体系中总的荧光值变化，无法对不同的产物分别进行检测。此时，就需要探针法的帮忙了。

来源：生工生物