荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（qPCR）通过仪器实时检测反应体系中的荧光值变化，能够准确体现出模板中相应基因的相对表达量变化，成为生命科学领域一项非常重要且常规的技术。这项技术不仅能够检测不同样本中相应的基因表达量，并且被广泛应用于临床疾病诊断、食品安全及动物疾病检测等等行业。 qPCR与常规PCR的共同点及区别 共同点：只要是PCR，就都涉及到DNA聚合酶的扩增以及温度循环过程，因此，常规PCR所含有的体…

关于PCR实验有哪些影响因素呢？我们一般想到的可能是获取的DNA/RNA质量、反转录的效率、引物的特异性乃至DNA聚合酶的保真度、扩增长度等问题，但很少有人会想到耗材的选择，可能也会影响您的实验结果。  银杏（学名：Ginkgo biloba L.）为银杏科、银杏属落叶乔木。因其已存在数万年之久，也被称为生物界的“活化石”。 关于其基因组的测序和信息分析，早在两年前就由华大基因、浙江大学…

逆转录反应，作为分子生物学研究的基本技术之一，已经广泛应用到多个研究领域，可以说是科研人员进行RNA功能研究的看家本事。 众所周知，逆转录的应用领域有以下6种： 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 定量RT-PCR（RT-qPCR） cDNA克隆和文库构建 cDNA末端快速扩增（RACE） 基因表达芯片 RNA测序（RNA-Seq） 今天，小编就整理了一些贴士，帮助大家在面对6种不同的应用时，如…

   一. RT-qPCR 基本原理和概念 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以 cDNA 为模板进行 PCR，在 PCR 扩增过程中，通过收集荧光信号，对 PCR进程进行实时检…

实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（thresh…

逆转录病毒颗粒内含有两个拷贝的RNA基因组，它们通过在多重区域碱基配对的方式连接在一起，尽管病毒包裹有两个基因组，但是当细胞被病毒粒子感染后，通常只能发现一个完整拷贝的病毒DNA，因此逆转录病毒粒子被认为是假二倍体。和负链RNA病毒基因组一样，逆转录病毒的基因组也是由病毒核衣壳蛋白(NC)沿着长轴包裹的，生化实验表明NC在逆转录过程中能促进模板交换，起着类似于原核细胞中单链DNA结合(SSB)蛋白…

qPCR是分子诊断学最常用的一种方法，它集高灵敏度、快速、高特异性于一身，因为它超强大的优势，众多实验室都会用到它。然而，大家都会被一些异常曲线、扩增效率、高低峰等问题困扰。下面尝试从引物设计到问题解决两个方面进行整理，让qPCR实验不再是烦恼。 引物设计原则 1. 引物长度：18-30bp，小编最喜欢22bp长度的引物； 2. GC含量：30%-80%，最好是40%-60%； 3. 引物Tm值最…

最近不得不说的就是由新型冠状病毒引起的全国性疫情。本着“口罩带好，论文接稿”的态度，本人老老实实待在家中，躺在床上一动不动。可是我那上进的师妹看到新型冠状病毒的检测方法qPCR，想到了一些奇怪的实验数据，微信上发来好多问题，刚好趁此机会，我们就一起学习这个经典不可或缺的实验qPCR。 最开始进入实验室时，就能听到一堆类似名词，RT-PCR、qPCR、real-time PCR。首先我们区分一下，q…

对照的目的是对检测的各个环节进行监控，因此我们按照检测的流程对对照进行梳理。常规荧光定量PCR的流程是：样品采集-运输-样品处理-核酸提取-反转录（RNA病毒）-扩增-结果读取。下面看看各个环节都可以使用哪些对照: 1.阳性对照（Positive control，PC）和阴性对照（Negative control，NC） 阳性对照和阴性对照是指在相同的处理条件下，比如一份已知的感染样品和一份已知的…

做完转录组分析之后，一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本的表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法，他的计算方法有很多，常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法，ΔCt法，2^-ΔΔCt法(Livak法)，用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。这里主要讲解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何计算； qRT-PCR原理 以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩…