分子克隆

    引物     引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸，最高不宜超过30个核苷酸，最佳长度为20-24个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5＇端多加几个碱基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体；两个引物中（G+C）%含量应尽量相似；引物内部应避免形成明显的二级结构，如发夹结构；两个引物之间不应发生互补；特别…

基本概念 1）基因工程（genetic engineering）、基因克隆、DNA重组、DNA克隆、分子克隆。 2）克隆（clone）：无性繁殖——应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子（重组子），再通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子，进行扩增、提取获得大量同一DNA，或其表达产物。 基因克隆的基本步骤 1）连接外源基因和克隆载体，构建重组DN…

PCR实验原理及步骤 PCR，又称聚合酶链式反应，基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 实验方法原理 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)…

电泳介绍 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核…

1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2、引物长度一般在15-30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于T…

核酸检测实验室想完全杜绝核酸污染是不可能的。核酸检测实验室的管理者和实验人员必须要认识到核酸污染是不可避免的，但是污染的频率和概率是可控的。我们要做的是时刻保持警惕，尽最大努力将污染的概率降到最低，并且能第一时间发现污染并及时进行处理。 先说说有史以来影响最大的实验室核酸污染事件 当地时间4月18日，《华盛顿邮报》(Washington Post)爆了一则重磅新闻，美国CDC在实验室生产的新冠病毒…

PCR技术概论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才…

雅培（Abbott）推出的新冠肺炎快速检测“神器”ID NOW 号称可以在5分钟内测试出阳性病例，13分钟内反馈出阴性结果。该神器一经推出就轰动全球，美国总统特朗普和FDA局长“直播带货”。但是近日，纽约大学在预印本上的一项的研究显示，ID NOW采用“干棉签法”测试，假阴性比例更高达48%。即便研究人员换用更精确的鼻咽拭子进行检测，漏检率也达到1/3。       …

什么是PCR？ 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。 PCR技术发展简史 PCR之父 Kary Mullis PCR反应基本原理和反应过程 基本原理： 反应过程： 变性——将被复制的DNA片段在高于其Tm的条件下（94~95℃）加热，使DNA双螺旋结构的氢键断裂二解螺旋，形成两条单链分子作为扩增反应的模板，…

PCR简介 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是基因扩增技术的一次重大革新，是分子生物学发展史中的一个重要里程碑。自20世纪80年代初发展以来，因其具有敏感度高、特异性强、快速简便等特点，在分子生物学、医学、遗传学、法医学、微生物学、食品检验、卫生检验等众多领域中具有巨大的应用价值和广阔的发展前景。 PCR 技术发展史简图 二、PCR反应前注意事项 1…