作者：李彦艳 哈尔滨市二院检验科
前言：细胞动力学是研究细胞群体内各部分细胞运动规律的学科。肿瘤的细胞增殖研究早期工作由于受方法学的制约主要限于实验肿瘤 ,随着分子生物学的飞跃发展和免疫组织化学技术的改进 ,多种与细胞增殖有关的生物标志物得以发现并逐渐有了深入地认识 ,检测方法不断更新。
细胞增殖检测主要分为几个门派：
①DNA合成检测 ②代谢活性检测 ③细胞增殖相关抗原检测
④ATP浓度检测 ⑤流式细胞术检测细胞增殖
1 DNA合成检测
DNA合成检测是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。
（1）：独家秘方：将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育几小时或者孵育过夜。这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器SC检测。
软肋:该方法时间耗时长，使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。
（2）用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
很可爱：不需要放射性物质。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。
讨人厌：需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。
图一 DNA分裂周期图片
（3）EdU（5-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
优点：与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等），可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。
图二 EdU及BrdU原理示意图
2 代谢活性检测
2、代谢活性检测 检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加，因此四唑盐或者Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。
四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。
MTT缺点：在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT主要作为终点检测方法。
更准确地反映DNA复制活性。
MTT试剂盒图片
其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒的。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。
XTT缺点：效率较低，需要添加额外的因子。而WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色。Alamar Blue的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞它就能够检测到。四唑盐和Alamar Blue氧化还原染料能够用于多种仪器和
高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等。
CCK-8的原理跟MTT其实是相同的，不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差。
优点：重复性优于MTT；对细胞毒性小；为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。缺点： CCK-8比MTT的价格要贵不少。
3 增殖标志检测
有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏这些抗原，可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期（非增殖期）不表达。用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。
4 ATP检测
细胞内的ATP含量受到了严格调控，检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础。如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。
5 流式细胞术检测细胞增殖
CFSE (5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯),会随着细胞分裂平均地分配到个子代细胞中从而通过其荧光的减弱反映标记细胞的增殖。
后记：细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，是生活细胞的重要生理功能之一。细胞的增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。我们在做实验时，应该熟悉每种方法的利弊，选择合适的试剂盒，使其更好地为临床服务。
参考文献：
① 刘迂，何泽生，吴金生《细胞增殖检测及临床意义》
②胡义平 , 刘叔文 `李晓娟,南方医科大学药学院 , 510515广州医学.院附属肿瘤医院药学部，广州510095《CCK-8法与FACS对CD3+抗体诱导小鼠Treg 细胞免疫抑制作用的比较 》`《现代免疫学 》 2013年第33卷第 1期
③图片来源于网络
