操作视频更新：传送门
对于生物狗和密集恐惧症患者来说，手动数细胞是一个极其无聊以及耗费精力的工作。
利用ImageJ进行自动细胞计数的工作流程（Workflow）：
一、自动细胞计数
1、打开想要处理的图像（File-Open，或者将图片直接拖动到菜单栏）
我们的目标是：自动对DAPI染色的细胞核进行计数，得到细胞核的总数。
2、将图像转为8-bit（Image-Type-8-bit）
RGB格式简介：一般彩色的荧光图片都是RGB格式的。RGB代表红、绿、蓝三种颜色，可以通过这三种颜色的叠加得到各式各样的颜色。
而RGB的每个通道各有256级亮度，用数字表示为从0、1、2...直到255。在0时最弱，而在255最亮。
例如，纯红色的R值为255，G值为0，B值为0，即（255,0,0）。灰色的R、G、B三个值是相等的（除了0和255）；黑色的R、G、B都为0,；白色的R、G、B都为255。
按照计算，256级的RGB色彩总共能组合出约1678万种色彩，即256×256×256=16777216。也称为24位色(2的24次方)。
当我们把一个RGB图像，转换为8-bit图像时，其实就是来了一个简单的缩放。使用以下公式转换为灰度：
[灰色=（红色+绿色+蓝色）/ 3] 或 [灰色= 0.299×红色+ 0.587 ×绿色+ 0.114×蓝色]
转换为8-bit之后，每个像素仅仅只有一个通道，有256级灰度，即0~255，表示亮度从深到浅，对应图像中的颜色为从黑到白。
3、调整阈值，去除背景，选中细胞核（Image-Adjust-Threshold）
注意选择Red来进行表征，所以变为红色的区域就是已经选中的区域。
注意背景是黑的，所以要勾选Dark Background！
这时候可能需要进行两项操作：
（1）如果图像带有比例尺：拖动调节阈值的上限可以去除比例尺（因为自动计数可能会把比例尺也当做细胞来统计）
（2）如果自动阈值效果不好：换拖动调节阈值的下限，可以增加选中区域，但要注意在选中细胞核的同时，尽可能少的减少背景。或者选择不同的自动阈值算法。
拖动完成后点击Apply，图片转为非黑即白的二值化图片：
5、填补细胞核的空隙（Process-Binary-Fill Holes）
在调节阈值减少背景的同时，可能细胞核的一些不均匀部分也被减弱了，可以填补空隙，使得细胞核变成实心球形。
6、打断细胞核的重叠部分（Process-Binary-Watershed）
细胞密度比较大时，通常会有细胞重叠或者贴近的情况。可以利用Watershed自动识别重叠部分，并将两个细胞核分离开来。
7、自动分析、计数颗粒（Analyze-Analyze Particles）
出现Analyze Particles界面，通过不同的情况设置参数，最重要的是红框中的参数。
Size：0.05-Infinity——指分析颗粒尺寸大于0.05（一定注意这里的单位是inch），一直到无穷大的颗粒。（根据细胞大小，以及结果好坏来更改）
Circularity：0.00-1.00——指圆度，可以根据细胞形状，调整需要的圆度，1.00为标准圆。
Show：Overlay——指原本图片上会展示出分析结果的外框。
Exclude on edges——处于边缘的颗粒不计入
设置完成后，点击OK，即出现以下结果：
可以看到最后统计出的细胞核数为147，且每个细胞核的面积也在Results中显示出来。可以放大检查原图中是否有多数或者漏数的细胞。
注意：自动计数并不是完全准确的，如果发现自动计数与实践明显出现偏差，出现多数或者漏数，需要优化阈值（Threshold）和颗粒尺寸的判断标准（Size以及Circularity）。并且形状无规则的细胞，例如神经细胞，不适于自动计数，需要手动计数，所以接下来介绍一下利用ImageJ进行手动细胞计数。
二、手动细胞计数
主要有两种方法：
1、Multi-point工具
双击可以更改点的形态、颜色和大小。使用的时候直接点击细胞，就会自动的标号。但对于多种细胞类型分别计数，并不是很便捷。
2、Cell Counter插件
这就显示出Fiji，相对于传统的ImageJ的优势了。基本能用上的插件，都已经包含在程序中，只需要搜索即可。例如我们在搜索框中输入：Cell，即可出现Cell Counter这个插件的选项。选中后，点击Run即可。
然后就会出现Cell Counter插件的界面，可以对多种细胞进行计数，并且在同一图像中显示出来。具体的应用其实非常简单，在这里就不再赘述了。
细胞自动计数和手动计数，大概介绍完了。如果想熟练掌握，可以随便百度一张红血球计数板的照片，按照上面的步骤一步一步操作即可。
