荧光共定位分析(colocalization)，是一种重要的荧光分析方法。
它的本质其实就是分析不同荧光标记的蛋白（这两种荧光必须有独立的发射波长），在空间中的重叠，从而判断这两种蛋白是否处于同一区域，即在同一像素上是否“恰巧”出现了两种不同的荧光分子。
共定位分析能间接地说明两个蛋白与同一结构有联系，但不是两种蛋白有相互作用的直接证据。荧光偏振能量转移（FRET）是研究蛋白质之间相互作用的一种比较直观的方法。
例如发表在Science Signaling上的这篇文章就用到了荧光共定位分析[1]：
为了证明NPY-pH（用绿色荧光标记）这种蛋白被分选在了某种类型的囊泡中，对这种囊泡的两种marker——Sgll和CGRP进行染色（用红色荧光标记），然后进行共定位分析。如果绿色荧光和红色荧光“总是”同时出现，那可以说明NPY-pH这种蛋白确实被分选到了这种囊泡当中。
作为定量分析篇，这篇文章就为大家介绍怎样利用ImageJ进行荧光共定位分析。
首先，与往常不同，荧光共定位分析的操作十分简单。但实现这一分析的算法有很多种。
这些其实都是为了回答一个问题，即怎么定量描述共定位分析。现在最常用的有以下两种算法：
1、皮尔森相关系数——Pearson’s correlation coefficient (PCC)
PCC是最常用的定量描述共定位的相关系数，取值在1到-1之间。1表示完美相关（有蛋白A的地方必有蛋白B）; -1表示完全排除（有蛋白A地方必定没有蛋白B），零表示随机关系（蛋白A和蛋白B随机分布，无联系）。
2、曼德斯共定位系数——Manders' Colocalization Coefficients (MCC)
M1、M2代表一种蛋白质与另一种蛋白质共定位的部分，占这种蛋白总量的比例。相当于是重叠比例。
这两种种算法（其实还有更多算法）都集成在了插件中，它们各有各的适用范围和优缺点。
这篇文章会介绍三种不同的ImageJ插件来完成这一分析。但共定位分析真正重要的，或者说是真正需要我们去思考的，是它背后的原理。这些算法都不是完美的，不同情况下，利用不同算法的参数，才能得到准确的结果。
这一篇先讲操作，共定位分析原理的解析见下一片文章。
如果想正确的应用这一工具，请先阅读原理解析和ImageJ官网对于共定位分析的说明，以及一篇综述[2]：A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy。
Don't treat this tool as a black box .
一、荧光共定位的操作（三种插件）
（1）Coloc 2（Analyze-Colocalization-Coloc 2）Fiji自带。下载地址：点击这里
这一插件是现在最新的共定位分析插件，而且说明也十分详细，集成了过去用于共定位分析的插件的很多功能。
这里我以ImageJ官网给出的一个样本为例，大家可以自行下载：点击这里
1、分离通道，保留有目标蛋白的两个通道（Image-Color-Split Channels）
这时可以看到这两个通道是黑白，没有颜色的。
2、给两个通道分别添加伪色（Image-Color-Channels Tool）
点击Channels界面里的More，给两个通道上色（Optional，只是为了更好区分两个通道）。
注意：Coloc2不能只能处理两张单张的图片，不能以Stack的形式进行分析，所以这里需要Split Channels，把这两张图片分别提取出来，进行后续的分析。
3、打开Colorc 2插件（Analyze-Colocalization-Coloc 2）
选好两个Channel，算法都勾选上，点击OK。然后会出现一个类似报告的结果，里面有皮尔森系数等等结果。
注意：图片如果为16-bit，应该提前转为8-bit，否则计算时间会非常长且结果有误。
在这里选择2D intensity histogram，即可得到散点图Scatter plot。
这些结果可以保存为pdf，也可以将数据导出。
注意：1、Threshold是指对图片的灰度设定一个阈值，高于多少才能被计算，作用是降低背景，去除不必要的。如果图片中物体与背景区分明显，可以很好进行Threshold，建议用above threshold的值。
2、建议将想要分析的区域框选出来，即选择特定的ROI，而不是对整张照片进行分析，具体原因可以参照解析。
（2）JACoP
WIKI：地址链接
下载地址：点击这里
这个插件需要在上面两个网址上下载，并放到plugins目录下，或者直接在Fiji的搜索框中搜索并安装。对于图像的预处理和前面一致。关于这个插件的原理和使用，可以参考这篇综述[3]：A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.
3、完成上面的第1、2两步操作后，打开JACoP插件（Plugins-JACoP）
勾选上所有的算法，然后点击OK。
这里填拍这张照片用的显微镜的信息，以及荧光的发射波长。
默认设置，点击OK。
设定适当的阈值，尽量减少背景，包含感兴趣的区域，点击OK即可得到结果。
（3）Colocalization Finder
这个插件需要在这里下载（点击这里），并放到plugins目录下，或者直接在Fiji的搜索框中搜索并安装。对于图像的预处理和前面一致。
这个插件现在已经没有人进行开发了，所以官网上建议使用最新的Coloc 2插件。
3、完成上面的第1、2两步操作后，打开Colocalization Finder插件（Plugins-Colocalization Finder）
选中两个Channel后点击OK，即可得到结果。
可见这个插件计算出的结果，和前两个插件有一定差别，建议使用前两款插件。
二、Plot Profile进行共定位分析描述
网上其实也有利用Plot Profile进行共定位分析，但这种方法其实只能描述，并不准确。
我以ImageJ自带的样本（File-Open Samples-Fluorescent Cells）为例，具体操作如下：
1、打开图片后，用直线/矩形工具框选感兴趣区域
注意左上角，这时候其实是红色这一通道。
2、打开Plot Profile（Analyze-Plot Profile）
这是红色通道荧光强度（灰度）沿着矩形的分布，然后点击live。
这时候向右拉到绿色通道，Plot Profile就会实时变化：
分别将Data导出，然后在同一坐标系中作图，即可得到不同荧光沿着该矩形距离的变化曲线。
为什么一个看似简单的共定位分析，需要用这么多方法、这么多参数来描述？为什么需要了解其中的原理？
下一篇我会对这些问题进行解答，敬请期待。
希望对大家有帮助~
参考文献：
[1].Wang Y , Wu Q , Hu M , et al. Ligand- and voltage-gated Ca2+ channels differentially regulate the mode of vesicular neuropeptide release in mammalian sensory neurons[J]. Science Signaling, 2017, 10(484).
[2].Dunn K W , Kamocka M M , Mcdonald J H . A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy[J]. AJP: Cell Physiology, 2011, 300(4):C723-C742.
[3].Bolte S , F. P. CORDELIèRES. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy[J]. Journal of Microscopy (Oxford), 2006, 224(3):213-232.
