免疫荧光（Immunofluorescence）：简称IF，与western blotting一样，也是根据抗原抗体反应的原理，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下进行观察，从而确定抗原或抗体的性质和定位，包括直接法和间接法。
一、实验步骤
1. 样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）
（1）对于贴壁细胞：
先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌 PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。
（2）对于悬浮细胞：有2种方法，
①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。
②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。
（3）对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。
（4）对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。
2、 固定（防止离体组织自溶抗原扩散）
固定液包括：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，不过，目前甲醛用的还是最多的，但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。
固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。
以细胞样品为例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。
3、通透（目的是使抗体进入胞内）
0.5%Triton X-100( 一种去垢剂，用PBS配制 )室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。
4、封闭（减少一抗和二抗与非特异位点进行结合）
通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。
5、一抗孵育
根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒， 4℃孵育过夜。回收一抗，加入PBST， 在摇床上缓慢摇动洗涤5min，共洗涤3次
6、荧光二抗孵育
用吸水纸吸尽洗涤液后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中孵育1h后，回收二抗，接着用PBST洗3次，每次5min；由于荧光容易淬灭，故从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都要避光。
7、复染核（定位的关键）
在玻片上滴加DAPI，并注意避光孵育5min，对标本进行染核，然后用PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI；
8、封片及荧光观察：用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察。
二、常见问题
1、弱荧光信号
| 可能问题 | 解决方法 |
| 错误的激发波长 | 确保激发波长与荧光基团激发光波长相匹配 |
| 不兼容的一抗或二抗 | 注意种属问题 |
| 固定过度或不充分 | 适当调整时间 |
| 样本保存不当 | 注意避光 |
| 一抗不好用 | 建议做阳性对照确认抗体的有效性 |
2、高背景
| 可能问题 | 解决方法 |
| 洗涤不足 | 充分洗涤，适当增加洗涤次数 |
| 样本干燥 | 在湿盒中孵育抗体，避免样本干燥 |
| 封闭不充分 | 延长时间或更换封闭液 |
| 抗体浓度过高 | 预实验滴定，确认最佳浓度 |
| 二抗非特异性结合 | 不加一抗，只加二抗，作对照 |
| 样本自发荧光 | 提前检测样本自发荧光情况 |
3、细胞/组织形态被破坏
| 可能问题 | 解决方法 |
| 组织切片从玻片上脱落或切片有气泡 | 适当增加固定时间 |
| 组织切片撕裂或有褶皱 | 切割刀片不太锋利，考虑重新切片 |
| 细胞或组织固定不充分，自发裂解 | 适当增加固定时间，使用交联性固定剂 |
三、注意事项：对照实验的设置
1、 内源性组织背景对照：某些细胞和组织可能有固有的生物学性质，会产生背景荧光，对结果产生影响，例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前，应对样品进行观察，确保抗原本身没有信号。
2、阳性对照：用确认含有待测抗原的组织或细胞，与待测标本进行统一处理，结果应为阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。
3、阴性对照：与阳性对照相反，用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。
| 问题 | 可能原因 | 优化方案 |
|---|---|---|
| 信号弱或无信号 | 目标蛋白在细胞中没有表达 | 制备细胞裂解液，用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达 |
| 染色细胞过少 |
表达目标蛋白的细胞过少 | 标本中使用更多的细胞，试用其他瞬时转染方法，或者使用稳定 |
| 转染细胞系
细胞通透性差 | 增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其它的通透剂 | |
| 染色前的固定步骤破坏了抗原表位 | 改用其他固定方法 | |
| 通透使抗原丢失 | 减少通透剂作用的时间或强度 | |
| 抗体不识别 | 换用其他抗体 | |
| 一抗稀释度过大 | 同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释比例 | |
| 二抗选择错误 | 使用正确的二抗 | |
| 背景过高 | 一抗质量不高 | 使用特异性高，效价高的一抗 |
| 一抗浓度太高 | 同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释比例 | |
| 二抗浓度太高 | 同一样品按最佳的一抗用量作二抗稀释曲线，以确定最佳的二抗稀释比例 | |
| 封闭不完全 | 使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭；改善封闭条件 | |
| 封闭液BSA中含IgG | 使用高纯度（IgG free）的BSA | |
| 洗涤不充分 | 充分洗涤 | |
| 细胞呈扁平状 | 细胞片被风干 | 在任何时候都不要让细胞片干燥；使用湿盒 |
| 使用了甲醇固定 | 甲醇可破坏细胞膜，因此不能很好保持细胞形态。改用甲醛或戊二醛等其他固定剂 | |
| 细胞有自发荧光 | 使用了戊二醛固定 | 在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光 |
| 材料本身（如石蜡）有自发荧光 | ||
| 细胞模糊，封片剂明亮 | 因洗涤不充分导致背景太亮 | 充分洗涤 |
| 二抗结合太弱 | 确保抗体牢固结合，确保固定良好 | |
| 整个细胞片都出现荧光亮点 | 二抗浓度过高 | 降低二抗浓度 |
| 二抗发生沉淀 | 过滤或离心荧光标记二抗 |
本文转自小张聊科研及相关网络内容整理
