细胞铺板密度
上周和果子老师做了一次免疫荧光。我们按我常做的密度铺板，发现第二天细胞就非常满了，说明细胞在不同的实验室环境下生长状态是不一样的。所以建议大家在做细胞铺板时，自己要根据别人的建议摸一个最适的浓度。原则就是细胞一定是单层生长，不要太密。最后可以有单个细胞的存在。细胞只有呈单层并且健康生长时，结果才是比较可信的。因为细胞密集以后，细胞会抑制生长，有些促进凋亡的蛋白就会增加，细胞的周期也会比较靠后，对实验的影响还是比较大的。
每个人铺板的手法不一致，所以有的人的板子是周围细胞多，有的人的板子是中间细胞多。这些情况都是有很多因素引起，这里只讲你滴入细胞后的处理。你在加入细胞后，需要均匀的晃动板子，可以呈8字形，也可以十字交叉。最好加入后放置水平台上2-3分钟，轻轻放进孵箱，保证它的平整。
细胞固定
细胞固定之前需要清洗细胞，这里需要注意，如果是自己配置的PBS，那一定要调PH并且过滤（0.44um）。这里清洗细胞建议用冰的PBS。
- 贴壁细胞，如果细胞比较好贴壁，需要边洗边拍。如果细胞贴壁不紧，那就要小心了。
- 悬浮细胞，是相反的，需要边洗边离心。
这里要说的是选用固定剂要根据自己的实验具体而定，固定时间不宜太长。固定液最好也用0.44um的滤器过滤一下。
细胞通透
如果你选用的是皂苷进行通透，需要注意细胞膜的可逆性通透，也就是孵育每个抗体都需要通透，并且皂苷通透无法到核膜。另外细胞还可用冰甲醇同时进行固定和通透，这样的话可以避免去垢剂的使用，但是细胞的自发荧光会强一些。建议组织的免疫荧光不要用此固定。
细胞封闭
上两次帖子中有人问说为什么不能用BSA封闭。我在此进行说明，我是建议在有条件的情况下尽量不要用BSA封闭。可以选择免疫荧光专用封闭液。
一抗
- 抗体的特异性
免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景及定位不佳的问题。在正常情况下，纯化的抗体效果会更好一些。这里需要强调，在你不知你的抗体性质及蛋白情况下，需要设立正确的对照。如果有阳性对照一定要设，而对于阴性对照，就是使用只有二抗染色的片子，这样有利于减少降低背景干扰。
- 合适的抗体稀释比例
通常免疫荧光抗体的稀释是1ug/mL的纯化抗体足够达到特异性染色的结果。抗体浓度过高时可能会出现假阳性（因为布朗运动）。所以再第一次使用抗体时或测定抗原时，建议做浓度梯度实验。
在前面的帖子，有老师提到说，他们在小鼠身上敲入一个带flag标签蛋白时，（因为此蛋白缺少抗体，所以后续检测都是用的Flag）做组织免疫荧光时，WB可以检测到表达，免疫荧光检测不到。不知道大家有没有相同的经历，或者大家认为什么原因导致了这种情况的出现。我在这里先说几种我知道的原因，在排除方法学错误的情况下：
- WB Flag的抗体不适用于IFA；
- 组织自发荧光较强，二抗选用绿荧光；
- Flag所接的蛋白分子量较大，抗原暴露不好。
如果大家还有其他的想法，欢迎留言讨论。
我没有遇到过上面的情况，我倒是遇到过以下几种情况：
- 只有蛋白全长免疫产生的抗体才可做免疫荧光，而多肽免疫的没有办法做。
之前做一个胞内寄生菌的时候，做出来一个小GTP蛋白与我的细菌有共定位，但是查阅文献时发现所有的报道都是说没有共定位。后来笔者导师发现我们所用抗体时全长蛋白免疫的，然后我们买回市面上所有和这个蛋白相关的抗体进行检测，发现只有全长的才可以。后来问了专门做蛋白和抗体的老师，他们的解释是多肽有时候抗原表位的识别位点不是蛋白所作用的位点，活性蛋白时有可能将此位点包裹。
- 免疫荧光检测得到，而WB检测不到
我自己包括上周果子老师的IFA时都遇到，WB检测不出，IFA可以检测出。这个应该可以理解，如果你这个蛋白的表达丰度比较低时，WB往往检测不到。
二抗
二抗的选择也是很重要的。如果做得是免疫相关的实验，那么二抗尽量选择预吸附的，并且进行单染实验。如果是二重或者多重染色，那就必须选择预吸附的了，且二抗的种属来源尽量一致。
封片
注意不要有气泡。片子要烤干
降低背景
背景高常常会是免疫荧光会遇到的问题。所以每一步都要小心。首先我会用二抗来源的血清代替BSA封闭，降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间。
来自微信公众号：果子学生信
