免疫组织化学（IHC）是许多实验室的主要免疫测定方法，用于证明重要蛋白质的存在与否，检测翻译后修饰，诊断疾病等等。IHC使用免疫学和生化技术，通过与目标抗原相互作用的标记抗体来检查不同的组织切片。可见标记或染色剂用于可视化抗体抗原相互作用。IHC可以可视化细胞的独特细胞成分，广泛被病理学家和诊断人员使用。
实验前
1、样品制备
上 午
2、脱蜡与水化
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将玻片在二甲苯中脱蜡2次，每次10分钟。
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将玻片转移到无水乙醇中2次，每次5分钟，然后分别通过95％，85％酒精一次，每次3分钟。
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用自来水冲洗玻片2次，洗掉酒精。
3、抗原修复
我们一般有使用两种修复方法，常以碱性Tris EDTA修复液为主，如果效果不好会换成酸性的。
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1XTris EDTA 修复液 PH8.0
Tris Base 1.21g EDTA 0.37g ddH2O定容至1L Hcl调整PH 8.0
1X 1M 柠檬酸缓冲液 PH6.0
柠檬酸钠 3g 柠檬酸 0.4g ddH2O定容至1L。
将300 ml 抗原修复液倒入染色容器中微波先将修复液加热15min，然后加入载玻片，中火微波15min，冷却至室温1h，可放在冰袋附近，但不可降温太快，防止载玻片破裂。(抗原修复液：cat#CPL,CBB(PH=6) cat#ETA、TES(PH＞6)cat#PSS（胃蛋白酶）cat#TSS（胰蛋白酶））
下 午
4、阻断
使用免疫组化笔，把待染色组织圈起来，以节约试剂使用。(免疫组化笔：cat#KPM)然后使用3% H2O2 室温孵育12min后 ，自来水洗，暂时浸泡在PBS中。(过氧化氢封闭液：cat#ACA)
5、封闭
使用ddH2O 配置的5%羊血清 37℃条件下孵30min后，将羊血清倒干净即可。（通用型封闭液：cat#AAA）
6、抗体孵育
一抗：将100μl适当稀释的一抗（在抗体稀释缓冲液中，例如含有0.5％BSA的PBS）涂在玻片上的组织切片上，37℃孵育 1h后。PBST（PBS+1%吐温20）洗3次。（一抗稀释液：cat#APG,ATG（绿色）cat#ABB，ADT（无色）
二抗：2滴/片 37℃孵育30min, PBST洗3次。（多价二抗:cat#ABN,反应种属: 小鼠，大鼠，兔，豚鼠 ；通用型二抗稳定剂cat#SZ03)
注：如果用的是生物素标记的二抗，应当加一步链霉亲和素偶联的HRP复合物37℃孵育15min。
7、显色DAB
A B液：50 μl色原+1ml底物。现配现用，7min内观察，有明显的组织显现就立即终止(PBS)，7min后还是不显色说明该组织不会显色，需终止反应。自来水冲洗3遍。底物:cat#ACV(DAB) cat#PRD(Permanent Red）cat#FRT(Fast-Red ）
8、复染
使用过的苏木素再次使用前要先捞出液体表面的一层氧化膜，然后染色90s，自来水冲洗3次。
9、分化
75%乙醇+1%Hcl分化 1s后，自来水冲洗3次。
注：目的是通过调整PH分化细胞膜和细胞质。
10、脱水
通过4次（85％2min，95％2min，100％2min和100％2min）的酒精使组织玻片脱水后，冷风将载玻片吹干。（吹风机：https://www.jd.com/）
之后使用二甲苯孵育10min。
11、中性树脂封片或者封片机
封片剂：cat#AML（水性）cat# FMM（荧光水性）cat#PMT（通用型）
