“我的WB又没有杂出来，太桑心了”
“哇靠你的WB又没有杂出来，用掉多少抗体了，还买进口的！”
“哇靠你的WB又没有杂出来，却一直一轮又一轮的占用着蛋白电泳仪，我等到黄花都谢了！”
麦子说，这些声音贯穿了她整个研究生生涯，WB，虐了她无数遍，然而凤凰涅盘然后浴火重生，她从WB中参悟到了正确应对失败的人生道理。而在正确应对失败的同时，我们也要学会如何避免失败。小鱼今天给大家分享一下在用磷酸化抗体做WB时，应该注意些什么。
1.警惕内部敌人
一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，因为组织或细胞裂解时会释放出大量磷酸化蛋白的死对头——内源性蛋白磷酸酶，催化磷酸化蛋白(R-p)的去磷酸化，导致不同于正常生理状态的差异。因此，外源性加入蛋白磷酸酶抑制剂，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维护蛋白质的磷酸化状态，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。
2.低温能让他们紧紧地拥抱对方
加一抗后最好4度过夜，低温能让抗体和目的蛋白紧紧地拥抱对方。为什么？因为蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附，高温下容易脱落。膜上的抗原脱落了，结合效率会低。4度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。（土豪随意）磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分，就像联谊舞会上让来宾多相处一会产生couple的概率会大很多那样，过夜可以保证抗体和蛋白有充分的结合时间。二抗则室温1小时即可。
3.磷酸化抗体哪家强？
当然是 Cell signaling公司。他家做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体。最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。
4．他们不宜“喝奶”
建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。因为脱脂奶含磷酸化蛋白丰富，是奶中磷元素的来源之一。
5.如何避免磷化蛋白君和总蛋白君在膜上“打架”？
研究完某一蛋白的磷酸化情况后一般也要研究一下该蛋白总的表达量。但两者的条带位置一样，怎么做？可以这样：压完磷酸化抗体后，把相同的membrane做strip后再压总蛋白抗体,然后再strip一次，再压内标actin。
6.听marker的，没错
做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的band以外,往往会出现非特异性的band。磷酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的band,而没有你想要的band,所以压片以后,一定要根据markers比对一下,你压出的band分子量是否正确。
7.洗涤也大有学问
洗涤对最后的背景影响也较大，millipore最近的说明书推荐用双蒸水洗涤，效果很明显，具体可以这样：1st and 2nd抗体之间，DDW 5min X3次，2nd抗体后，DDW 5min X3次，TBST 5min X1次，DDW rinse 3-4次。对比TBST洗涤的membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使压片30min，背景仍然是可以忽略的。
