1.确定样本中磷酸化蛋白的表达量
对的样本，正确的处理方法和合适的阳性对照是实验成功的第一步。
对的样本：实验前需先查阅文献或通过预实验检测该样本是否表达，若该样本根本就不表达目的蛋白，那就不要浪费感情了吧；
正确的处理方法：若正常情况下样本的磷酸化水平过低或不表达，可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，刺激条件各不相同。但这并不代表刺激越多越好，充分但不过分（如磷酸化IRS1，仅需刺激5min，刺激过久会进入负反馈机制进而开始降解）的正确刺激会帮助得到最佳实验结果；
合适的阳性对照：在任何实验中，我们都应考虑包含适当的阳性和阴性对照，可使您进一步确定抗体检测到的特异性信号。关于详细的刺激方法和阳性对照，可以参见CST官网http://www.cst-c.com.cn/tools/Controls_Table.html。
２.总蛋白和内参对照都要做
普通的内参如Actin、GAPDH等和总蛋白抗体的对照都要做吗？对，都要做！普通内参可以作为体系的对照，保证上样量一致从而排除体系本身的影响，对于结果分析比对十分重要。
同时，总蛋白抗体也必不可少，仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的增加并不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值增加了才能说明磷酸化水平增加，这种表述实验结果的方法是最客观的，也是必需的。
3.确保完全裂解并使用新鲜样本
相对于仅用裂解缓冲液裂解，裂解液裂解+超声处理可确保整个细胞充分裂解并剪切染色质DNA。建议在35%-40%的功率输出条件下超声3次，每次10s。由于不同仪器不同性能，请根据生产商的建议进行优化。
超声处理时应保持低温，冰上操作。如果您没有探头超声仪，用细的注射器针头反复吹打也能起到类似的作用。在得到样品后，请不要反复冻融，建议-80℃冰箱分装保存。
4.小心蛋白杀手
组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，导致不同于正常生理状态的差异。因此，在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维护蛋白质的磷酸化状态，非常重要。否则条带很浅不说，结果可信度还不能保证。
注意：PMSF#8553 要新鲜配置。
5.样品低温处理
除超声时保持低温，在做磷酸化蛋白的整个实验过程中都要保证低温环境。磷酸化蛋白在室温条件下很容易被蛋白磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制剂也很明显。所以务必要保持！低温！环境！
6.用5%脱脂牛奶的TBST室温封闭1h
网络上流传的磷酸化抗体不适于用牛奶封闭的说法是没有科学依据的。这一误区的出现可能是由于实验者使用了非实验级奶粉引起的（国内许多奶粉含有磷酸酶等杂质）。CST建议转膜后迅速在TBS中洗涤膜几秒，以便移除残留的转膜缓冲液，随后使用5%脱脂牛奶（请使用实验级的#9999）的TBST室温封闭1h，这一封闭步骤有助于降低非特异性一抗结合并降低背景。
另外应避免膜封闭时间过长，因为这会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。CST建议所有抗体均应如此。CST科学家生产验证每一支上市的抗体的每一种应用，显然更懂得如何让抗体表现出最佳的状态。封闭完后，孵育一抗前最好在TBST中洗涤5min。
7.一抗稀释液
请务必根据产品说明书中推荐的稀释液稀释一抗，不同产品有不同最佳稀释液，采用CST推荐的一抗稀释液并按标准protocol 操作实验，是您实验成功的保证。
8.4℃条件过夜孵育一抗
抗原抗体之间是一种非共价的结合，蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附抗体，这种物理吸附在高温下会变弱，容易脱落，因此，首先保证4℃抗体孵育条件非常重要。其次要保证抗原和抗体相互磨合孵育的时间，磷酸化蛋白只占总量的极少部分，过夜可保证充分结合进而曝出更漂亮的条带。哪怕不是磷酸化蛋白，CST也推荐4℃过夜孵育，让结果呈现最好的一面。
9.洗膜条件
一抗和二抗均建议用1*TBST （相对于PBST缓冲液，最终信号会更强）洗膜3次，每次5min。洗膜时间不宜过长或过短，过长会导致信号减弱（抗体从结合的位点脱落），过短则会导致背景深。另外，洗膜的时候，盒子要比膜稍微大一圈，保证膜充分的在洗涤液中晃动，且建议单张洗膜而非几张一起清洗。
10.二抗室温1h孵育
用5%牛奶的1*TBST稀释的二抗（BSA稀释二抗会产生较高背景），室温1h孵育即可。
11.掌控好曝光或压片时间
磷酸化蛋白检测除了容易有杂带外，还容易出现高背景。所以曝光或压片的时候注意掌控好时间，时间太长会使得背景深，过短又会不容易曝出条带或曝出条带很浅，所以需要优化出适合自己靶蛋白和实验体系的最佳曝光时间。
12.磷酸化和总蛋白抗体到底怎么孵育？
一般磷酸化和总蛋白的条带位置基本是一样的，所以如果样品比较珍贵或有限的情况下，可以在压完磷酸化抗体后，将膜strip后再压总蛋白抗体，stripping的时候注意温度尽量控制在50℃以内。不过CST的做法是建议在样品充足的情况下同时跑两块胶，比strip效果会更好。
13.蛋白Marker很重要！
做磷酸化蛋白WB时，除了目的蛋白的条带外，还可能会出现一些非特异性条带。所以在此情况下，请一定要根据marker大小进行比对，查看条带的分子量。否则有可能会误以为一些非特异条带是自己想要的，分析半天走了冤枉路不说，还耗费了大量精力。
