Western Blot最全攻略：从protocol到问题解决

蛋白免疫印迹（western blotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测3个部分组成，是根据抗原抗体特异性结合检测样本中某种蛋白的方法，与ELISA不同的地方在于WB是一种半定量的检测方法。操作流程如下：

下面详细介绍一下每个操作步骤：

一、样本的制备

（1）样本一般是组织和细胞，根据样本类型的不同，选择合适的裂解液：

（2）抑制剂，根据研究的目的蛋白进行选择，假如要检测磷酸化的蛋白含量，就要对磷酸酶进行抑制，现在很多公司都有多种抑制剂的混合物

（3）要加入loading buffer（BME、DTT，目的是减少蛋白高级结构的形成）

（4）煮沸变性：一般是99°C，10min，水浴锅煮沸时，防止EP管盖弹开，使水浴锅内的水进入。

二、凝胶电泳

（1）配胶。这里说的都是SDS变性胶，先配分离胶，再配浓缩胶。根据目标蛋白分子量的大小，选择合适的分离胶浓度，分子量越高，分离胶的浓度越低。浓缩胶一般用的都是5%。配胶时需注意以下几点：

①玻璃板清洗后，为了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置几分钟，拿出来的时候一定要晾到室温再灌胶，不然很容易产生气泡；

②配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存，当我们按比例配好混合液的时候，要等混合液恢复室温时，再灌胶，不然也很容易产生气泡；

③加水液封时，速度要慢，可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动，不然很容易将分离胶冲变型。

（2）电泳

采用SDS-PAGE电泳，每孔上样量为10μl总蛋白，上样时，先加marker，如有空置的加样孔，须加等体积的1×loading buffer，以防相邻泳道样品的扩散。开始电压为80v，使样品跑得慢一些，充分浓缩，到达分离胶后调为120v，电泳至溴酚蓝要跑出即可终止电泳，对10-12%的胶来说，80-90min足够，对15%的胶来说，时间要再延长一些，然后进行转膜，关于电泳液，也可以回收1-2次，根据实验室情况决定。不过建议先配10x的，然后现用现稀释。

三、转膜

（1）关于膜的选择

现在用的最多的是PVDF膜，用之前需注意：①先在甲醇中浸湿膜15s，保证膜由不透明变成半透明；②小心将膜放入双蒸水中浸泡2min；；③小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少5min

（2）转膜液

转膜之前先提前配好1x转膜液，放在4°C冰箱。对于小分子量蛋白质（＜100），按照10x转膜液：甲醇：蒸馏水=1:2:7的比例配制1x转膜液；对大分子量蛋白质（＞100），可加入10%的甲醇，并且适当加入SDS，浓度控制在0.1%范围内。

（3）转膜时间

按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择合适的转移时间。下表是转移时间，可以做一个参考：

（4）转膜方式—湿转

转膜在冰浴中进行，凝胶和转印膜之间不要留有气泡，因为气泡是绝缘的，假如气泡位于凝胶的条带处，该处条带就不能转移到膜上了，同时要注意电极方向。

（5）转膜效率

如果想看转移后的效果，可对凝胶进行染色，常用的是丽春红染色，但其实有一个更简单快速的方法就是通过预染marker来判断，看凝胶上是否有marke残留以及转印膜上marker的清晰度。

四、免疫学检测

（1）封闭（降低背景，占据膜上剩余的结合位点，使抗体只能与膜上的抗原特异性结合）：一般用的封闭液有5%的BSA和5%的脱脂奶粉，但对于磷酸化的抗体或生物素标记的抗体不能用脱脂奶粉，只能用5%的BSA。封闭时间室温1-2h即可

（2）一抗孵育：封闭结束后，用TBST稍微洗一下膜，并将一抗用稀释液进行稀释，具体的稀释比例因抗体不同而不同，需做预实验确定。通常用自封袋进行一抗孵育，2-5ml即可，孵育时间推荐4°C摇床过夜。一抗孵育时，要注意一抗的种属来源。

（3）洗膜：一抗孵育结束后，回收一抗，用TBST进行洗膜，5min/次，洗4-5次即可。

（4）二抗孵育：洗膜结束后，加入二抗，室温摇床1-1.5h，然后回收二抗，再次洗膜。二抗的种属要与一抗的来源相对应，例如一抗是兔抗，二抗就要是抗兔抗的抗体。

（5）检测

酶标抗体：化学发光检测，ECL

荧光抗体：要在激光扫描成像仪进行结果观察，例如Odyssey、STORM

五、常见问题及解决方案

1、无条带或弱条带

2、非特异性条带

3、高背景：一般目的条带弱，延长曝光时间后，均会产生高背景

4、有较多污点

5、条带位置偏移/错误