上次跟大家分享了一个做WB的小技巧如何做出简简单单的WB背景？今天我们来接着分享。
刚开始做WB遇到很多问题，可能刚开始接触WB的小白们也能会遇到，借此分享一下，有不对的地方请WB前辈指教。
2. 配胶：如果刚上手做WB，一定要在配胶前验漏，懒一下说不定就会体验到一遍又一遍配胶一遍又一遍漏掉的绝望。如果已经很熟悉自己的器材，可以省略。配胶用的架子都是损耗品，这是配胶反复漏液，不管怎么调整都没用的时候才知道的。不过在在损耗初期还是可以凑合用的，方法见下图，万能的枪头，哪儿都可以看到它的身影。
我常用的是1.5mm的板，最开始配胶的时候把握不住分离胶加到什么位置，导致浓缩胶不是太长就是太短，当夹板顶在透明架子最下方就是3号线的位置时，分离胶加到2号线的位置大概6.8ml左右的样子就可以啦，这样1号和2号线中间浓缩胶长度刚刚好。分离胶加好以后加满水或者异丙醇界面还会往下压一点点，不会太多。
如果非常着急，可以稍微多加2ulTEMED，不过剧毒的东西还是少用为妙吧。。。配好以后总有多余的液体，先别急着倒掉，等管里的液体凝好了，差不多可以准备下一步了。
配好的可以第一天配好胶包保鲜膜放4°，这样第二天时间比较充裕。保鲜膜要多包几层。
3. 上样：先别急着拔梳子，把胶装好内槽灌满缓冲液再拔，好处有三：一看下内槽漏不漏；二 拔梳子阻力较小，减小破坏胶的可能性；三 上样方便。
提蛋白和变性的过程没有什么好的建议，如果做细胞的话，各组细胞量差不多其实可以不定量，毕竟WB的灵敏度做不出来小的差别，而且定量方法并不是很准确。可以做预试验，根据条带适当调整下上样量。
我用的是广谱彩虹Marker，避免广告嫌疑就不说牌子啦，自己调整一下用量到条带清晰即可，毕竟这是裁条带的唯一参考。经费充足的话可以一块胶上两个Marker，这样裁条带的时候方便对齐。
4. 跑胶：恒压还是恒流看实验室传统吧，各显神通，个人感觉影响不大。
5. 转膜：我们用的是PVDF膜，甲醇激一下大概各种贴子里都有讲过。制作三明治的时候，准备一个平盘，或者类似容器，把三明治原材料全部泡在转膜缓冲液中一层一层叠加就好啦。在缓冲液中制作很容易调整各层位置，保证对齐，同时基本不用担心气泡的问题。转膜时会产热，相信大部分实验室没有配专门的冰盒。实验前准备好若干小冰袋，最好内容物是凝胶状的冰袋，可以压的很平整。转膜前放在槽中，一方面降温效果好，另一方面可以省一点转膜液……外部降温用冰和大冰袋就随意啦。
6. 裁切：转膜完成后真的不用丽春红染，浪费时间而且染不出来会让你怀疑人生（真的有怀疑过……）。准备白色背景板一个，长短刀片各一，长刀片当尺子用，短刀片我们用的是手术刀裁膜用。我的白色背景板用的是2L装75%乙醇的桶，只有想不到没有做不到啊。。。。
7. 封闭：关于配方，我只用过5%脱脂奶粉（实验用），但是网上有大神介绍过各种复方，如果有需要可以尝试。我只想说，不要太省牛奶，WB没有结果原因分析都能写一整页，但是不要因为牛奶太少影响结果。另外，让摇床轻轻摇着就好，不用制造地震强度，个人经验摇太快封不好，然而不懂为什么。
8. 一抗孵育：杂交盒第一对抗体的需要量较大，第二固定长宽对条带的限制很大，所以我更喜欢杂交袋。刚开始做的时候没经验二十几个条带封一抗封到想哭，掌握好杂交袋的脾气后一切都so easy。
首先，裁一张合适大小的杂交膜，保证对折后除条带外留出边距即可。然后，摆好条带，对折杂交膜，将两个边封口，刚封完膜非常烫，用湿抹布擦一下就可以顺利平整的揭下来杂交袋啦。由于是整张膜对折形成的，所以左侧边不会有印，配好的一抗可以轻松倒进去，再封好上口就可以得到一个圆滚滚的杂交袋啦。注意，封上口时让一抗稍微溢出可以保证杂交袋内没有气泡。我的一抗直接放4°冰箱过夜（通常10-12h），并没有摇床，效果一直还好。
9. 洗膜及二抗孵育：还是一样，摇床不用太快。另外，不同条带混在一起洗是可以的，保证TBST量足够就可以了。我用的是某1ml枪头盒的上盖当容器的。。。大小刚好，深度足够，很好用。TBST洗10min，4次，这是在某一次脏兮兮的背景之后师姐给的建议，重新洗过之后干净了，从此意识到了洗膜的重要性。
我用的国产二抗，并且是借的。。。1：5000稀释，长期不用冻起来，短期反复用放4°。
10.显影：第一部分已经介绍过。ECL发光液用的是碧云天的。（Emmm….过期貌似也没有非常大影响，出于不浪费考虑，我用实验室冰箱里发现的祖传发光液跟新的发光液对比过…..）
11.其他：实验中用到的器材大到转膜槽，小刀镊子都清洗干净并晾干或烘干方便使用。缓冲液、牛奶、一抗、二抗都可以回收反复用，但是内槽的电泳和转膜缓冲液一定要用新的。条带很多或者反复回收条带的时候标记清楚，用圆珠笔标在marker或者空白的位置，对其他条带没有影响。。。膜有正反，标数字也可以帮助辨别。
好了，今天就策到这里，希望对各位新手有帮助。
