Western blot窍门分享 技术中心, 蛋白免疫印迹 • 2021年8月28日 下午11:19 做了两年半的Western blot，真的是遇到了太多不可思议的、解决不了的问题，犹记得刚进实验室的时候，学会了WB像是学会了全世界，殊不知这只是科研实验的一块小砖头，如今快要毕业了，还在每天跑着WB补实验。今天在这里跟大家分享一些做WB 的小窍门，能让你节省时间，跑出完好看的条带。 一、蛋白提取 1、不管你提取的是组织蛋白还是细胞蛋白，RIPA裂解液和PMSF都是必不可少的使用试剂。常规情况下，我们从试剂公司购买的RIPA都是100ml的体积，但就算是提取组织蛋白也就只用500-800ul，那么即便你身处一个大实验室，一瓶RIPA也可以用上至少一个学期。所以建议大家根据个人使用量将RIPA分装保存，避免反复冻融，但是不要将PMSF和RIPA混合后再分装，这样会影响PMSF的作用效果。（参考推文：Western blot提取蛋白时DTT和PMSF等蛋白酶抑制剂你真的了解吗？蛋白怎么煮最合适？） 2、loading buffer的主要作用是指示蛋白、沉降蛋白，所以在煮沸蛋白之前，都需要根据蛋白的体积计算好1*loading buffer的量，二者充分混合后煮沸5分钟。但是很多新手都会忘了loading buffer的另一个作用——还原剂。如果没有加loading buffer又或者加入量不足，无法使蛋白质的二硫键充分打开，影响蛋白质的迁移率。所以如果你遇到明明应该是一条蛋白条带，发光后却是两条，那你不妨试试适当多加一些loading buffer。 二、制备分离胶和浓缩胶 1、如果你够细心会发现，不同浓度的分离胶主要区别在丙烯酰胺和水的比例上面。30%的丙烯酰胺主要的作用就是构成三维网状的凝胶使得不同分子量的蛋白在电泳过程中区分开。所以可想而知丙烯酰胺在制胶中起到的作用有多大。之前在网上看到过有同学说，为什么使用不同厂家的丙烯酰胺，蛋白的分子量会有很大差异，问题很有可能就是出在丙烯酰胺的身上，即便30%丙烯酰胺的官方配比是如此，不同厂家的质量还是会不同。所以，建议大家在同一厂家购买丙烯酰胺，同时注意4度避光保存。因为丙烯酰胺具有神经毒性，不建议各位自己配制。 2、小六儿所在的实验室，WB是个走量的活儿。因为只有一个电泳仪的的电源，所以每天三台电泳仪需要重复跑三轮。所以很多时候为了节省时间，分离胶和浓缩胶的凝固时间都不是很充足。这样做的弊端就是即使视觉上乙醇压平了分离胶液面，拔出梳子后各个孔隙已经形成，但是分离胶和浓缩胶还没有形成稳定的三维网状结构就已经开始跑上蛋白了： a) 蛋白条带是波浪型而不是直线； b) 同一时间下各组蛋白不在一条直线上，分子量不准； c) 下部的分离胶凝固不均匀，条带直接跑花了； d) 浓缩胶没有凝固充分，蛋白没有充分压缩，主要影响到小分子量的蛋白条带曝光后会特别粗。 所以，即使这是个走量的活儿，但它也是个细节决定成败的活儿。分离胶和浓缩胶凝固后，最好让其在室温下稳定一段时间，再进行下一步，心急吃不了热豆腐。 三、机器维修和维护 新时代对研究生的要求是：不仅要会做实验，还要会修机器。上一段小六儿说道，因为本人所处的实验室WB 很走量，这也就导致了WB 的相关机器损耗的很厉害，每学期平均要修理2-3次，大部分问题都出在正负电极头腐蚀折断或连接正负电极的电线烧断。 a) 每次做完WB清洗机器的时候，玻璃板可以用自来水冲洗，但是机器本身最好使用三蒸水清洗； b) 机器长时间使用，会在机器本身产生很多锈迹，这时候可以用棉签蘸取盐酸进行擦拭。擦拭掉锈迹后再用三蒸水冲洗； c) 机器也要避光放置，不要被阳光直射； d) 机器使用年头过长，锈迹或者本身老化的原因，都会使机器的电阻变大，所以你也可以通过观察显示屏上电流的大小判断机器的好坏。尽量不要将老化的机器和新机器放在同一个电源下跑WB，这样只会缩短新机器的使用寿命。 最后给大家分享一个实验好物：快速转膜液。我们平日配制的转膜液需要添加甲醇，转膜时间根据分子量不同1-3小时不等，同时还要保证转膜处于低温条件下进行。现在很多试剂公司都推出了快速转膜液，用乙醇配制，30分钟即可完成转膜，并且不用控制转膜时的温度，效果很好用，性价比很高。 以上就是本人总结的一些WB小窍门，祝福各位都能顺利快速做完WB！
