最近不得不说的就是由新型冠状病毒引起的全国性疫情。本着“口罩带好，论文接稿”的态度，本人老老实实待在家中，躺在床上一动不动。可是我那上进的师妹看到新型冠状病毒的检测方法qPCR，想到了一些奇怪的实验数据，微信上发来好多问题，刚好趁此机会，我们就一起学习这个经典不可或缺的实验qPCR。
最开始进入实验室时，就能听到一堆类似名词，RT-PCR、qPCR、real-time PCR。首先我们区分一下，qPCR（Quantitative Real-time PCR）一般认为是real-time PCR的简称，即为实时定量基因扩增荧光检测系统，可以对原始模板数量进行精准的检测。而RT-PCR是逆转录PCR（Reverse transcription PCR）, 是将RNA模板反转录成DNA再进行扩增的实验。这里需要注意虽然real-time PCR和Reverse transcription PCR的前缀都可以缩写为RT，但是我们一般认为RT-PCR是逆转录PCR。
（图片来自网络）
首先我们要了解qPCR的实验原理，简单来说就是PCR扩增过程中，通过荧光信号的收集，以扩增和熔解曲线的方式对PCR进程进行实时检测。
一、实验操作
qPCR的实验操作可谓说是比较简单，有一套详细的说明书各位小伙伴们都不在话下，但是还有一些小tip!
1. 试剂耗材准备：qPCR的操作简单但是要严谨！建议小伙伴们提前备好耗材和试剂！
耗材保证：无酶无菌，个人建议尽量选择进口枪头，减少液体挂壁，更为准确。（使用过很多厂家的八连管，进口的不管是做工还是结果上，本人都觉得更好，也欢迎小伙伴们好货推荐！）镊子提前高压，加样所用金属托架提前放置冰箱降温。
2. RNA提取和反转录：低温操作！Trizol提取时注意蛋白质层的分离！Mix配置后切忌不可反复冻融！注意空气中小片段核酸污染！RNA提取后不可久放尽快反转录！
3. 体系配制：注意避光！首先口罩戴起，头发扎好；每个样品设置3个平行孔，保证数据真实可用；反转录时可能同一样本核酸有多个小EP管分装，建议配体系时尽量转移一个管中混匀后加样，保证平行孔间数据稳定；没有排枪的小伙伴们加样只要手法稳定也是能保证结果的。（建议新手们提前在实验记录本上规划好加样安排，操作时不易出错，整理数据时也清晰明了。）
4. 上机操作：上机前首先离心，如果管内有“顽固”气泡可以用手指轻轻弹就能完美解决！加完的样本不能久置，须立刻上机。
（金属托架：图片来自网络）
二、曲线分析
qPCR结果的分析主要就是对曲线的分析，这次我们主要了解扩增曲线（Amplification curve）和熔解曲线（Dissociation curve）。
扩增曲线（Amplification curve）：随着PCR反应的进行，荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强，通过荧光强度检测扩增产物量的变化。
理想的扩增曲线是S型，有明显的四个时期，我们主要分析形状奇怪的扩增曲线。
1. 没有对数增长期的扩增曲线，无Ct值
可能原因：引物或探针降解；模板量不足或模板降解。建议试剂不要反复冻融；
2. Ct值出现过晚的扩增曲线
可能原因：扩增效率低，建议各位小伙伴可以使用核酸电泳优化反应条件，比如降低退火温度；（当ct值较大>38，本人试过在反转录时即采用特异性引物进行反转录，并加大核酸浓度，效果有所改善）
3. 扩增曲线出现向下或向上的尖峰
可能原因：反应过程中电压不稳定，也可能为卤素灯老化。
熔解曲线（Dissociation curve）：随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。
熔解曲线上有特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），一般通过熔解曲线判断扩增产物是否单一。
1. 熔解曲线主峰前有杂峰
可能原因：存在比目的片段短的非特异性片段，也有引物二聚体的可能；
2. 熔解曲线主峰后有杂峰
可能原因：存在比目的片段长的非特异性片段；
熔解曲线的问题，小伙伴们还是主要注意，引物设计和浓度是否有问题，同时操作时注意污染和镁离子浓度是否过高。
三、数据处理
对于qPCR数据的分析主要是绝对定量和相对定量。
1. 绝对定量主要使用标准曲线的方法；对于科研小伙伴们，主要通过相对定量来分析目的基因的表达差异。
2. 相对定量，主要使用的方法为双标曲线法和2^-△△Ct
首先要明白的就是Ct值的定义：PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
因此分析定量时目的基因Ct值取15-35较好。内参基因的Ct值一般在13-15左右较好，需要注意的是：平行孔之间Ct值相差不要超过0.5，这也是为何建议设置3个平行孔的原因。
2^-△△Ct为最常用的方法，表示实验组中目的基因较对照组中目的基因表达的差异倍数，
计算公式首先：△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组）
△Ct（实验组）= Ct（实验组目的基因）- Ct（实验组内参基因）
△Ct（对照组）= Ct（对照组目的基因）- Ct（对照组内参基因）
最后表达水平的差异倍数Fold Change=2^-△△Ct
当△△Ct>0时，目的基因呈现下调趋势，△△Ct<0时，目的基因呈现上调趋势。
qPCR是个简单不失严谨的实验，大量操作价格也不低，因此小伙伴们初次进行或者更换厂家试剂盒时，不妨通过预实验熟悉试剂盒说明书和操作细节，以免大量操作结果无法掌握且耗时耗力。qPCR虽不如WB使人抓耳挠腮，但是科研青年们也要深入了解其原理以备不时之需呀。最后，疫情期间大家还是要注意身体健康，同时奉上本人导师一句话：既然不能出门，那你们就刚好在家读文献写汇报吧！祝各位，努力拼搏，只争朝夕，绝不延毕！
