qPCR是分子诊断学最常用的一种方法，它集高灵敏度、快速、高特异性于一身，因为它超强大的优势，众多实验室都会用到它。然而，大家都会被一些异常曲线、扩增效率、高低峰等问题困扰。下面尝试从引物设计到问题解决两个方面进行整理，让qPCR实验不再是烦恼。
引物设计原则
1. 引物长度：18-30bp，小编最喜欢22bp长度的引物；
2. GC含量：30%-80%，最好是40%-60%；
3. 引物Tm值最好在60℃左右，上下游两条引物Tm差异不要超过4℃；
4. 避免引物与目的基因之间发生错配，特别是引物3端，不要超过6个碱基；
5. 避免特定碱基的连续重复，特别是引物3端出现3个或以上连续的C或者G重复；
6. 避免引物自身形成发夹结构；
7. 避免引物之间形成二聚体，特别是引物3端；
8. 引物设计跨内含子，这里上下游引物可以在不同的外显子，或者同一个引物刚好跨两个外显子；
9. 引物特异性比对：NCBI primer-blast。
扩增产物大小：
1. 80-300bp，150bp最适长度，相对短的扩增产物，扩增效率会要高；
2. 产物GC含量30%-80%，最好是40%-60%。
可能出现的问题
好的引物对于qPCR实验成功至关重要，但是难免会出现一些小问题，接下来就谈谈可能会出现哪些问题，以及这些问题该如何解决。
1. 无Ct值出现
a. 检测荧光信号的步骤有误；
b. 引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
c. 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
d. 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况；
e. 循环数不够；
f. 模板量太低；
g. 上下游引物Tm值差异太大。
2. Ct值出现过晚（Ct>38）
a. 扩增效率低: 反应条件不够优化，设计更好的引物或探针，改用三步法进行反应，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；
b. PCR各种反应成分的降解或加样量的不足；
c. PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度；
d. 引物或者模板降解；
e. PCR体系，比如Mg离子浓度。
3. 标准曲线线性关系不佳
a. 加样存在误差：使得标准品不呈梯度；
b. 标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；
c. 引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针；
d. 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
4. 对照有信号
a. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；
b. 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；
c. 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒；
d. 模板有基因组的污染。
5. 溶解曲线不止一个峰
a. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；
b. 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；
c. 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的试剂盒；
d. 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入；
e. 引物非特异扩增。
6. 扩增效率低
a.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；
b. 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法；
c.反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
7.扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？
a. 参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)；
b. 模板的浓度太高或者降解；
c. 荧光染料的降解。
典型案例
案例一
一个样品的三个复孔检测，用的是cDNA样品，SYBR Green法。
原因分析：
左图可能原因：仪器检测波动（如光源、滤光片、信号采集等）导致的偶然现象，重复实验应该会消失；
右图可能原因：1. 模板浓度太高或者携带有抑制物。过高模板浓度和抑制物会导致不同孔之间的平台期抑制出现时间不一致，导致峰高峰低; 2. 仪器温度控制、荧光检测系统有问题，需要结合qPCR仪检测的其他样品深入分析。
案例二
两个样品的三个复孔检测（空细胞对照组和病毒处理实验组），用的是cDNA样品，SYBR Green法。
原因分析：
左图：扩增曲线上升平滑，可能原因样本本身扩增效率较低，如模板带有抑制物、扩增子高GC、扩增长度太长等，再加上产物积累产生的抑制效应导致；
右图：溶解曲线非单一峰，将PCR产物进行凝胶电泳，确定目的峰和非特异峰。
这里电泳结果可能有两种结果：
第一种结果是病毒处理实验组出现两条明确的条带。一条带与空细胞对照组相同的条带（引物扩增大小相同），一条比目的条带大的条带。
原因可能如下：
1. 引物设计跨的内含子太小，导致扩增到基因组，可以选择跨越更大的内含子设计引物。
2. 引物非特异性扩增，可以尝试提高退火温度
3. 两种方法都行不通，需要考虑重新设计引物。
第二种结果是病毒处理组出现一条明确的条带（与空细胞对组相同的条带大小相同），且在泳道上出现严重的弥散条带。
可能原因如下：
1. 病毒感染组的病毒存在中或者病毒感染细胞后细胞产生qPCR的抑制物，对样品处理时需要用PBS清洗细胞几遍再进行RNA抽提；
2.需要将降低RNA的反转量，同时反转时加入基因组去除试剂。
