逆转录反应，作为分子生物学研究的基本技术之一，已经广泛应用到多个研究领域，可以说是科研人员进行RNA功能研究的看家本事。
众所周知，逆转录的应用领域有以下6种：
- 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
- 定量RT-PCR（RT-qPCR）
- cDNA克隆和文库构建
- cDNA末端快速扩增（RACE）
- 基因表达芯片
- RNA测序（RNA-Seq）
今天，小编就整理了一些贴士，帮助大家在面对6种不同的应用时，如何正确选择逆转录酶。
逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
在RT-PCR中，逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过PCR反应扩增cDNA,为下游实验提供研究模板，因而逆转录酶是实验成功的关键步骤之一（如下图）。选定的逆转录酶应对所有样本均具有最高效率，即便是难转录RNA样本，如降解、抑制剂残留或具有高度二级结构的RNA样本。
图. 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。RT =逆转录，RTase =逆转录酶
常用的RT-PCR方法分为一步法和两步法，每种方法都各有优缺点，简要概述如下：
表. 对比一步法和两步法RT-PCR
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定量RT-PCR（RT-qPCR）
定量RT-PCR（RT-qPCR）的最常见应用之一是通过对细胞和组织一段时间或事件后（如，药物治疗）实时mRNA水平的定量分析。RT-qPCR比RT-PCR的灵敏度更高， RT-qPCR基因表达定量的准确性在很大程度上取决于cDNA模板的质量和数量。因此，逆转录对于RT-qPCR的成功至关重要。所选择的逆转录酶应该具有以下特点：
- 高效合成cDNA的能力，即使是对低丰度基因以及次优质和/或难转录RNA样本。
- 在宽的RNA起始量范围内，cDNA的动态范围或线性度最佳，可确保基因表达定量的准确性。
- 所选试剂在扩增过程中应产生较高且一致的cDNA得率，以获得具有高灵敏度和低变异性的基因表达结果。可考虑预混液形式的逆转录酶用以可以减少实验误差。
RT-qPCR的一个特殊程序是从未经RNA分离的粗细胞裂解物直接进行逆转录。在使用稀缺样本或选用群体内特定细胞的实验，可考虑使用直接RT-qPCR法来防止可能的样本损失和低RNA回收。
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cDNA克隆和文库构建
cDNA文库可由代表特定样本中转录序列的cDNA克隆组成。因此，文库提供了关于特定细胞类型、器官或发育阶段的基因时空表达信息。cDNA文库克隆可用于鉴定新型RNA转录物、测定基因序列和重组蛋白的表达。
构建cDNA文库的必要条件是RNA可适当代表其全长和/或相对丰度，因此，逆转录酶的选择非常重要。具有高持续合成能力的逆转录酶可以合成长cDNA，并捕获低丰度RNA。同样，在对具有高度二级结构的RNA进行逆转录时，建议使用热稳定性较强的逆转录酶。
cDNA末端快速扩增（RACE）
cDNA末端快速扩增（RACE）是一种基于PCR的方法，可用于确定cDNA 5'和3'末端的未知序列。通常，这些方法分别被称为5' RACE和3' RACE。
在5'RACE中，任何长度的（甚至包括未到达mRNA 5'末端的）第一链cDNA都将具有添加序列（即同聚物尾部结构或接头），随后通过PCR进行扩增。为了最大化全长cDNA的合成，应选择具有最小RNA酶H活性、高持续合成能力和高热稳定性的逆转录酶。
在3'RACE中，全长cDNA并不重要，因为不会扩增PCR起始位点的上游序列。但是，最好选用可生成长cDNA的逆转录酶，因为没有到达PCR引物结合位点的cDNA不会出现在RACE分析中。
基因表达芯片
在选择逆转录酶以制备用于基因芯片实验的cDNA靶标时，获得高产量全长cDNA的能力对于良好覆盖RNA来说至关重要，包括富含GC或具有二级结构的RNA序列。同样重要的是，为确保获得高信噪比，逆转录酶必须能够有效整合修饰的核苷酸，从而能够准确且无偏差地检测输起始RNA。
RNA测序（RNA-Seq）
随着二代测序（NGS）的出现，RNA-Seq已经成为用于分析全转录组（即转录的编码和长非编码RNA）、测定基因表达、发现剪接变异和融合转录物以及检测低丰度基因的的高通量方法。与基因芯片相比，RNA-Seq的优点包括动态范围更大、灵敏度更高以及可在无基因组信息的情况下表征RNA序列。
逆转录酶的保真度可能在RNA测序等序列准确度至关重要的情况下发挥重要作用。逆转录酶的保真度指的是RNA逆转录为DNA过程中的序列精确度。保真度与逆转录错误率成反比。据报道，基于MMLV的逆转录酶错误率在合成15,000到27,000个核苷酸中有一个错误核苷酸，而AMV逆转录酶表现出更高的错误率。
逆转录酶可展现出末端核苷酸转移酶(TdT)活性， 对于RNA测序（RNA-Seq），TdT活性可以诱导逆转录酶特异性地向cDNA3′末端加入一系列Cs。在高浓度镁和/或锰离子条件下的cDNA合成期间及合成后阶段，这种类型的TdT活性会被触发。结合特殊设计的具有3’Gs(称为模板切换寡核苷酸)的DNA寡核苷酸，TdT活性可以特异性地修饰3’cDNA末端和5′ RNA末端。这些序列修饰的实例包括引入用于随后cDNA合成步骤的限制性位点和/或用于下游RNA测序步骤的接头添加。
来源：赛默飞生命科学
