如何选择一个合适的样本进行NGS检测？

近年来,随着精准医疗的不断发展，结直肠癌(colorectal cancer,CRC)与二代测序（Next-generation sequencing,NGS）的组合不再陌生。CRC是人类最常见的恶性肿瘤之一。针对表皮生长因子受体的靶向治疗（如西妥昔单抗的应用），在晚期CRC治疗的临床实践中已取得了良好的效果。然而，其疗效除受大家已经熟知的KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA等EGFR下游基因状态的影响之外，与CRC相关的其它基因突变也可能会影响到其靶向治疗效果及患者的预后。因此，系统而准确检测CRC相关突变就显得格外重要。

与传统的单基因突变检测方法相比，NGS具有更高的灵敏度，并且使用较少的DNA量，即可一次性检测多个基因的突变，其成本也相对较低。然而，随着NGS在肿瘤分子诊断中的广泛应用，肿瘤细胞含量、肿瘤的异质性等因素对NGS的影响也越来越凸显出来，并给检测带来了很大的挑战。那么，为了更好的应用NGS进行肿瘤的分子诊断，病理工作者该如何选择一个合适的样本呢？

中国医学科学院肿瘤医院病理科应建明主任研究团队新近在Cancer letter上发表的题为“Major challenges related to tumor biological characteristics in accurate mutation detection of colorectal cancer by next-generation sequencing”的一篇文章，对NGS检测CRC突变所遇到的样本选择问题进行了梳理和汇总，该文章可以为我们带来一些思考。 

文章回顾性研究了中国医学科学院肿瘤医院病理科的756例结直肠癌样本。其中9例样本由于肿瘤细胞比例过低（<10%）或DNA质量较差而舍弃。最终利用NGS技术，对747例样本进行了22个肿瘤相关基因（Ampliseq Colon and Lung Cancer Panel）的检测。747例样本中包括709例单一样本、22例来自11对原发灶和转移灶的配对样本、10例来自5对同一肿瘤不同蜡块的样本及6例来自3对化疗前后的配对样本。

研究结果显示，53.0%（396/747）的样本，存在RAS突变(KRAS或NRAS突变)。在57.1%（431/747）的样本中发现了RAS/BRAF/PIK3CA突变(KRAS、NRAS、BRAF或PIK3CA突变)。有84.2%（629/747）的样本均检测到了突变(22个检测基因中的任意突变)。

在所有22个的基因中，最常见的突变基因是TP53(56.2%)，其次是KRAS(48.6%)、PIK3CA(9.6%)、FXBW7(5.1%)、NRAS(4.7%)、SMAD4(3.7%)和BRAF(3.5%)（Fig 1）。

Fig 1. Summary of cancer-related gene mutationsin Chinese CRC patients

研究者通过对数据的进一步分析，对我们如何选择合适的CRC样本进行NGS检测，给出了如下提示：

1，对样本中肿瘤细胞含量进行准确评估是至关重要的。

研究者根据肿瘤细胞含量将样本分为了三组：第1组（27例样本）肿瘤细胞含量为10%-19%；第2组（192例样本）肿瘤细胞含量为20%-30%；第3组（528个样本）肿瘤细胞含量>30%。研究发现，无论是从RAS、RAS/BRAF/PIK3CA突变，还是所有突变来看，第3组都比第1组的突变率高（p<0.05）。将活检样本和手术样本分组分析后，在前者中仍然得出了以上结论，但在后者中三组样本的突变检出率并没有统计学差异（Fig 2.）。

以上结果表明，大多数肿瘤细胞含量≥10％的手术样本都可适用于NGS检测。但在分析肿瘤细胞含量低的活检样本时，应特别注意假阴性的可能，特别是当样本很小，或伴有坏死、粘液湖、大量淋巴细胞或其它检测（如免疫组化）已有很多样本消耗者。

Fig. 2. Mutation distribution in different tumor cellularity groups

2，CRC的肿瘤细胞存在分子遗传学（突变）异质性。与RAS突变相比，肿瘤内异质性更易发生在PIK3CA突变的肿瘤中。

肿瘤的分子遗传学（突变）异质性对CRC患者的靶向治疗是一大挑战。研究者借鉴了Normanno等报道的异质性评分（heterogeneity score，HS）值来评估肿瘤内突变的异质性。

研究结果显示，PIK3CA的HS值明显低于KRAS、NRAS和BRAF。通过对RAS和PIK3CA同时突变的47例样本的分析发现，PIK3CA基因的突变丰度要显著低于相应的RAS基因的突变丰度（Fig 3.）。

这些数据表明，与RAS突变相比，肿瘤内异质性更可能发生在PIK3CA突变的肿瘤中。同时也支持RAS突变常发生在CRC的早期阶段，而PIK3CA突变可能发生在肿瘤进展期的理论。

Fig. 3. Estimation of intratumor mutational heterogeneity

3，原发性和转移性肿瘤的突变状态存在高度一致性，当转移肿瘤无法获得时，可用原发肿瘤替代检测。

研究的747个样本中，原发性肿瘤样本656个，转移性肿瘤样本91个，原发性和转移性肿瘤之间的突变状态并没有显示出差异（Table1）。进一步分析非配对的原发性和转移性肿瘤之间的KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA突变的HS值，也没有观察到显著差异。

此外，分析11对原发灶和转移灶配对样本，11例配对样本中的10例突变状态相同（Table2）。

4，化疗可能会影响CRC的突变状态。

对未进行化疗患者的624例样本及化疗后患者的105样本的分析发现，无论是RAS突变、RAS / BRAF / PIK3CA突变，还是含有任意突变的突变检出率，均是化疗前高于化疗后。由于化疗会杀死肿瘤细胞，降低肿瘤细胞含量而导致假阴性，所以进一步分析了肿瘤细胞比例>20%的样本，仍然可得出以上结论，提示化疗可能会影响CRC的突变状态。

对其中一个病例（case470）化疗前后的两个样本检测结果的分析显示，化疗后，之前的TP53突变消失，出现了另一个新的TP53突变，其原因可能与取样差异或化疗药物诱导基因变异有关，具体机制还需进一步研究。综上所述，肿瘤细胞含量低、肿瘤异质性以及化疗都可能会影响NGS检测CRC基因变异的准确性，选择合适的样本是NGS检测的关键。此外，多区域、重复活检或使用循环肿瘤DNA动态监测可能有助于NGS更加准确的检测CRC中的突变。