PCR简介
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是基因扩增技术的一次重大革新，是分子生物学发展史中的一个重要里程碑。自20世纪80年代初发展以来，因其具有敏感度高、特异性强、快速简便等特点，在分子生物学、医学、遗传学、法医学、微生物学、食品检验、卫生检验等众多领域中具有巨大的应用价值和广阔的发展前景。
PCR 技术发展史简图
二、PCR反应前注意事项
1，模板的用量
模板的用量往往取决于模板类型和反应体系。以50 μl反应体系为例，人基因组DNA，建议起始量为0.1-1.0 μg；大肠杆菌基因组DNA，10-100 ng；λDNA，0.5-5 ng；质粒或病毒DNA，0.1-10 ng。浓度过高会导致非特异性扩增，过低会导致产物量下降。正常情况下，适当提高模板浓度，减少循环次数，可提高PCR扩增的保真度。
2，模板完整性
模板的完整性主要是通过核酸电泳来判断，电泳结果若在23 kb左右有一条完整条带，则证明DNA完整性比较好。电泳结果中若出现弥散或无明显条带，则DNA可能发生降解。
3，模板的纯度
模板的纯度一般通过分光光度计测定，通常OD260/OD280比值在1.8～2.0认为DNA的纯度比较好，大于2.0可能存在RNA污染，小于1.8可能存在蛋白质污染。另外，模板中如果有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白等的污染，会大大降低扩增效率。
引物
1，引物设计
在PCR扩增时，引物是决定扩增特异性与产量的最重要因素之一，所以引物序列的设计尤为重要。通常可借助引物设计软件辅助引物设计，比如NCBI网站的Primer BLAST在线工具、Primer 5在线工具、Primer Premier引物设计软件、Oligo 引物设计软件等。另外，小编也整理了一份引物设计原则供小伙伴们参考：
2，引物使用建议
终浓度要求在0.1-1 μM，通常使用0.2 μM。对于简并引物、随机引物，可适当增加引物使用量，切记用量不要过高，否则会降低PCR的特异性。若模板量多且结构复杂（如人基因组DNA）时，适量减少引物用量提高特异性；反之，模板量少（如质粒模板）时，适当增加引物用量，提高PCR产量。
PCR 试剂
PCR反应除了模板和引物外，还需要准备DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、反应缓冲液和稳定剂等组份按照一定配比组成的试剂作为反应环境。为了实验的方便性，商业化PCR试剂大多做成2x即用型PCR Mix，大大节约了加样时间、最大限度地减少了人为误差、降低污染几率。市面上存的的PCR种类也比较多，需要根据实验的目的不同选择适合的PCR Mix，小编根据实验经验总结了以下建议，供参考：
a，菌液或质粒等PCR验证实验建议首选常规PCR mix；
b，多重PCR、高特异性PCR或高通量实验时建议首选热启动PCR mix；
c，长片段扩增（≥10kb）时首选长片段PCR mix；
d，在分子克隆、测序和定点突变、SNP等保真度需求高的实验时首选高保真或超保真PCR mix；
e，复杂模板或高GC含量的模板扩增时首选高GC或超保真 PCR mix。若扩增效果不是很理想，可以尝试加入甲酰胺或二甲基亚砜（DMSO），并以0.5 mM梯度递增镁离子浓度，最高到4 mM进行优化体系时。
三、PCR反应程序
PCR 反应在预变性之后就进入一个重复过程，这个重复过程主要包括三个关键步骤，模板的加热变性、引物与单链模板的复性以及在热稳定DNA聚合酶的作用下复制延伸。整个重复过程结束后可选择增加终延伸，主要是对产物不完整末端的填补，确保全长复制以及高目标DNA片段的得率，同时，Taq DNA聚合酶的“加A尾”反应也在此步进行。
变性
1，预变性
通常预变性温度为94 ℃-98 ℃，反应时间一般1-10 min。根据DNA聚合酶不同选择适合的预变性温度及反应时间是PCR反应顺利进行的关键，充分的预变性有利于DNA双链的打开。高GC等复杂模板，根据DNA酶的耐热性情况可适当提高预变性温度。
2，变性
通常变性温度为94-98 ℃ 孵育10-60 s，取决于DNA聚合酶的耐热性、模板复杂度、目的片段的长度等。
退火
退火温度取决于引物的Tm值，通常为50～60 ℃（Tm ± 5 ℃），退火时间一般为10 s - 1 min。
适当提高退火温度，可以相对减少非特异性扩增，但会降低产量；适当降低退火温度，可以提高产量，但会降低特异性，根据实验的具体情况可以进行相应的调整。
延伸
一般延伸温度范围在68-78 ℃之间，通常设置为72℃，取决于聚合酶活性，延伸时间取决于目的片段长度及聚合酶的延伸速度。
循环数
通常为25-40，取决于DNA起始量、DNA聚合酶的扩增效率和目的片段的得率等。DNA起始量低，建议适当增加循环次数。循环数过多会增加PCR结果的碱基错误率。
